1.灭菌不彻底造成的污染：

在培养基灭菌过程中，由于没有严格遵守操作规程，或由于仪器故障，导致灭菌不彻底，造成培养基污染。这种原因造成的污染的特点是污染百分比很高，一般达到80%~90%，而细菌是造成污染的真菌的大多数。根据污染的特点，只能对污染的原因做初步判断，进一步的确认还需要实验。取几个装有培养基的试管，用同样的方法灭菌。灭菌后，放入28培养箱中培养。如果几天后培养基上长出杂菌，可以断定是灭菌不彻底造成的污染。如果4~5天后培养基上没有杂菌生长，说明灭菌过程没有问题，污染是其他原因造成的。如果通过实验证实是灭菌不彻底造成的污染，就要从灭菌过程中的操作器械上找原因。对于高压蒸汽灭菌，操作中最常见的问题是排出冷气的时间不够；灭菌箱放置过紧(如叠放在一起)，导致中间部分气体流通不畅，灭菌时间不准确，压力表失效。所以要严格按照操作规程操作。常压间歇灭菌首先要检查蒸煮时间是否从水烧开开始。

2.灭菌后操作造成的污染：

如果空白培养基试验证明灭菌过程没有问题，那么污染的原因可能发生在灭菌后的操作过程中。其中接种操作最容易产生污染，由于接种操作没有按照无菌操作规程进行，容易造成大量污染。操作应严格按照无菌操作规程进行。

3.灵芝子实体表面的污染：

在培养过程中，子实体表面有时会感染一些霉菌，最初感染的部分并不大，扩散面积越来越大。当培养条件不适宜时，如培养基营养不良、温度和湿度不足，或通风和光照不良，子实体不能在较好的环境条件下生长，发育受阻，抗病能力降低，易受真菌感染。改进方法是改善培养条件：更换培养基；改善培养的温度、湿度、通风和光照条件，使之适合灵芝的生长发育。另外，要严格检查菌种质量，接种无污染的优良菌种。