质谱测序是霰弹枪蛋白质组学领域的常用策略。首先对蛋白质进行酶切步骤，然后根据酶切规律预测肽段序列，从而预测质量电荷比，根据质量电荷比进行后续的定性和定量分析。通常分为以下三个步骤：

第一步是消化成多肽。

第二步是将肽送到质谱仪进行分析。

第三步是多肽鉴定。

如图所示：

第一步是消化成多肽。其中最常用的是胰蛋白酶，它在精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)位点切割蛋白酶。根据胰蛋白酶的酶解规律，消化后的肽大部分成为“胰蛋白酶消化肽”。酶水解蛋白质以产生复杂的多肽混合物可能非常复杂，因为胰蛋白酶在消化后平均产生50个多肽。因此，在蛋白酶解前，一般采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离，将所有蛋白组分分离为子蛋白组分，以降低样品的复杂性。肽选择通常在蛋白质酶解后进行，以选择具有特定性质的肽(如糖基化肽、磷酸化肽等)。输出的多肽样品通过反相色谱进一步分离。

第二步是将酶解肽段送至质谱仪分析。多肽从反相柱中出来后，被电离并气相化，之后特定离子进入串联质谱仪(MS/MS)生成片段离子质谱仪(MS/MS)。数据采集流程如下：

质谱仪扫描所有肽离子并记录主质谱的质电荷比(m/z)和丰度。选择的肽段离子(也称为前体离子)然后在质谱仪的碰撞池中分裂成更小的片段离子。得到的次级质谱(MS/MS)是母离子产生的所有碎片离子的质荷比和丰度。根据MS/MS质谱仪的裂解规律，可以确定产生片段离子的肽段的氨基酸序列。碎片离子通常通过碰撞诱导离解(CID)、电子转移离解(ETD)和高能碰撞离解(HCD)产生。有一些更先进的质谱仪可以进一步分解离子以产生三级质谱。

质谱分析仪的质量精度和分辨率对质谱信息有重要影响，从而对后续的多肽鉴定有重要影响。质谱仪的精度可以低到百万分之几百万(ppm)，例如LTQ-Orbitrap高质量精密仪器。对于低质量的精密仪器，精度仅为500ppm。即使拥有高质量精度的仪器，要实现真正的高质量精度，还需要优化仪器设置、控制室温、计算校准等步骤。质谱仪的质量分辨率意味着能够准确测定肽段的离子电荷状态，高质量的分辨率可以在较窄的质荷比范围内解析MS/MS质谱数据，从而排除无关数据的影响。

蛋白酶切(Digestion)成肽段。

第三步是肽鉴定。分析的关键是根据MS/MS质谱数据鉴定相应的肽段。多肽鉴定策略大致可分为以下四类：数据库搜索法是通过比较蛋白质序列数据库中由理论酶切形成的实验光谱和理论光谱来鉴定多肽；通过比较实验光谱和理论光谱，利用光谱库检索方法对多肽进行鉴定。de novo测序方法直接从质谱数据预测肽段，而无需数据库的帮助；肽序列标记是数据库搜索法和从头测序法的结合。首先通过从头测序法识别3-5个残基的短序列标签，然后通过数据库搜索法识别整个肽段。如下图所示：

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