1、陈永贵1、翁1、2、陆晓峰1、钟1、范文洲2、陈1、张会文2、何建国1、2。

俗话说，磨刀不误砍柴工。只有认真学习了养虾知识，才能解决后期养虾过程中的各种突发情况，有效提高养虾产量。

1.中山大学海洋学院水产品安全教育部重点实验室，广东广州510275；2.中山大学生命科学学院，广东广州510275)

摘要：近年来，我国南方凡纳滨对虾养殖场50%以上的对虾在养殖30天后爆发疾病，导致养殖对虾80%以上死亡。病虾的临床症状是肝胰腺萎缩坏死，活动减少，虾在池底死亡。发病初期，水面和池塘边均未观察到患病对虾，所以养殖户通常称此病为“偷死病”。病虾的主要症状是肝胰腺萎缩和坏死，所以我们称这种虾病为虾肝胰腺坏死(HPNS)。从2012年3月至2013年10月，从我国南方的广东、海南、广西三省的12个养殖区采集患有HPNS症状的凡纳滨对虾进行组织病理学观察、病毒检测和人工感染、细菌分离鉴定和人工感染研究。组织病理学研究表明，出现HPNS症状的病虾肝胰腺坏死，部分区域肝胰管细胞消失，肝胰管之间的结缔组织减少。用PCR方法检测了305份HPNS对虾中的11种对虾病毒，并用人工病毒感染健康对虾。受感染的对虾没有表现出HPNS病毒的症状。从63只感染HPNS的对虾肝胰腺、血淋巴和肠道中分离鉴定出383株细菌。这些细菌分属10属49种，每只虾中混合有多种细菌，其中从38只虾中分离出副溶血弧菌，从34只虾中分离出蜡样芽孢杆菌，从20只虾中分离出苏云金芽孢杆菌，从19只虾中分离出霍乱弧菌。选用副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌分别通过注射和浸泡感染健康对虾，所有感染对虾均出现HPNS症状。结果表明，许多细菌与凡纳滨对虾HPNS的爆发有关。

关键词：凡纳滨对虾；肝胰腺坏死；细菌；病毒

凡纳滨对虾是目前世界上最大的养殖对虾品种，占世界养殖对虾总产量的70%。中国凡纳滨对虾养殖产量占全球产量的30%，2012年中国凡纳滨对虾养殖产量达到145.32万吨。近年来，在中国、泰国、越南、印度尼西亚、印度和墨西哥的对虾养殖场爆发了一种称为早期死亡综合征(EMS)或急性肝胰腺坏死综合征(AHPNS)的对虾疾病。EMS/ahpn已经给全球养虾业造成了严重的损失。近日，我国南方凡纳滨对虾养殖场在养殖30天后，50%以上爆发了一种疾病，导致80%以上的养殖对虾死亡。病虾的临床症状是肝胰腺萎缩坏死，活性降低，死于池底。水面和池塘边都观察不到患病的对虾，所以养虾人通常称这种病为“偷死病”。肝胰腺萎缩和坏死是患病对虾的主要临床症状，因此我们称这种对虾疾病为肝胰腺坏死(HPNS)。尽管HPNS对虾和EMS/AHPNS对虾均出现肝胰腺坏死，但HPNS对虾不同于EMS/AHPNS对虾，后者在对虾养殖早期(通常在7-30天)死亡，并迅速发展。据报道，EMS/AHPNS是由一种毒性副溶血弧菌病原体引起的。与EMS/AHPNS相比，HPNS的爆发和发病相对较慢，HPNS一般发生在凡纳滨对虾养殖30天后。池塘养殖的虾不会在短时间内死亡，而是逐渐死亡，养殖90天左右死亡率达到80%。

为了研究对虾HPNS的暴发是否与细菌和/或病毒有关，本文进行了研究

2012年3月至2013年10月，从中国南方广东、海南和广西三省的12个凡纳滨对虾主养殖区采集了具有典型HPNS症状的病虾的肝胰腺、血淋巴和肠道样品。为了检测细菌或病毒病原体，在现场处理和保存患病的虾样品。采用无菌操作方法在现场采集患病凡纳滨对虾的肝胰腺、血液和肠道，用接种环分别接种于LB、TSA、TCBS和BHI平板培养基上。将平板培养基密封并带回实验室进行细菌的检测和鉴定。将现场采集的病虾样品冷冻在冰盒中，包装带回实验室，在-80下保存，用于检测虾DNA病毒和人工感染病毒。同时，将对虾的不同组织保存在-80的RNAlater溶液(USA)中进行对虾RNA病毒的检测。收集病虾样本，用Davidson的sAFA组织固定剂固定，进行组织病理学分析。

1.2凡纳滨对虾肝胰腺坏死的组织病理学观察

收集36只HPNS对虾的肝脏和胰腺，用Davidson的sAFA组织固定剂固定。12 ~ 24h后，用=70%酒精保存。将固定后的对虾组织用无菌去离子水洗涤12小时，然后用为50%、70%、80%、90%、95%、100%的梯度酒精分步脱水。二甲苯透明并上蜡，包埋在石蜡中，切片，用苏木精-伊红(H&E)染色，在光学显微镜下观察并拍照。

1.3凡纳滨对虾肝胰腺坏死病毒的PCR检测

用酚氯仿法提取HPNS对虾基因组DNA，检测对虾DNA病毒。用Trizol法(美国)提取HPNS虾总RNA，用Primescript1stStrandnbs。

p;cDNA SynthesisKit(TaKaRa，Japan)试剂盒进行逆转录以检测HPNS对虾RNA病毒。针对各种对虾病毒性病原的高度保守区段设计特异性引物，采用PCR检测方法分别检测白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾杆状病毒(BPV)、斑节对虾杆状病毒(MBV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、黄头病毒(YHV)、桃拉综合症病毒(TSV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)、莫里恩病毒(MOV)、罗氏沼虾诺达病毒卫星病毒(XSV)和生长缓慢综合症病毒(LSNV)。对虾病毒检测所用引物均由Invitrogen公司合成，引物信息见表1。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后于72℃延伸10min。PCR扩增产物经w=1%琼脂糖凝胶电泳检测后分析。
1.4  病毒人工感染
实验所用健康凡纳滨对虾(均质量5g)由中山大学海洋生物技术研究开发中心珠海基地提供。选取容积为0.8m3的水族箱，试验用水为天然海水，水温28～32℃。选取大小均一适中、活力较好的对虾放入水族箱暂养3～5d，24h充气，每天按时喂料并吸污换水，直至对虾生长状况稳定。感染试验分组前，随机选取10尾试验对虾进行对虾病毒检测，没有检测到病毒的对虾可进行病毒攻毒试验。
小心剥离30尾具典型HPNS症状的病虾头胸甲，称取病虾头胸部用10倍体积的无菌PBS用匀浆器在冰上匀浆，匀浆液在5000r/min离心10min，上清经0.45μm滤膜过滤，10倍体积PBS液稀释用于对虾感染。实验健康对虾分为过滤组、未过滤组和对照组3个组，每个组设3个平行组，每个平行组30尾对虾。过滤组和未过滤组分别用0.5mL过滤液和未过滤液稀释液注射感染健康对虾，对照组注射等量无菌PBS缓冲液，观察7d。感染7d后，每个平行组随机选取5尾对虾进行病毒检测。
1.5  肝胰腺坏死症凡纳滨对虾细菌分离和鉴定
从HPNS病虾肝胰腺、血淋巴和肠道分离的细菌在LB，TSA，TCBS和BHI不同培养基上28℃培养24h，挑取优势单一菌落在培养基中再次划线纯化和培养，直至获得纯化的单一菌落。采用传统微生物学鉴定方法进行细菌鉴定。细菌16S rDNA基因扩增采用细菌基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，Beijing)提取细菌基因组DNA。16SDNA扩增反应的引物为通用引物，正向引物序列：5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'，反向引物序列：5'－GGTTACCTTGTTACGACTT－3'，由上海英骏生物科技有限公司合成。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后于72℃延伸5min。PCR扩增产物经w=1%琼脂糖凝胶电泳检测后送上海英骏公司测序，测序结果用BLAST软件进行同源性比对，ClustalX软件进行多序列比对，MEGA4.0软件进行系统进化树的构建，以进行细菌种类鉴定和分析。
1.6  副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌人工感染凡纳滨对虾
选取来源于HPNS对虾肝胰腺的副溶血弧菌(VP)和来源于HPNS对虾肠道的苏云金芽孢杆菌(BT)，分别采取肌肉注射感染及浸泡感染方式进行凡纳滨对虾肝胰腺坏死症细菌人工感染。
注射感染对虾分为4个组，每个组设3个平行组，每个平行组30尾对虾，分别注射细菌浓度为106cfu.mL－1的VP、BT和VP+BT菌液50μL/尾，对照组对虾注射等量无菌PBS，注射剂量均为50μL/尾。浸泡感染也分为4个组，每个组设3个平行组，每个平行组30尾对虾，感染对虾分别用细菌终浓度为105cfu.mL－1的VP、BT和VP+BT菌液浸泡，对照组用天然海水浸泡。不同方式感染对虾观察14d，记录对虾感染症状和死亡情况，从感染对虾中分离和鉴定细菌，同时取感染对虾组织用AFA组织固定液固定，用常规组织学方法进行组织病理学检测。
2  结果
2.1  肝胰腺坏死症凡纳滨对虾症状和组织病理观察
患HPNS对虾的主要症状是活力减弱，摄食减弱或不摄食，肝胰腺边缘不清晰呈弥散状，最后肝胰腺萎缩坏事(图1－a，图1－a')。与健康凡纳滨对虾(图1－b，图1－b'，图1－c)比较，患病对虾肝胰腺肝小管B，F，R细胞坏死或脱落，肝小管间结缔组织松散或坏死，严重者肝小管崩解(图1－d)。
图1  HPNS对虾症状和组织病理观察
a：具HPNS症状的病虾，箭头指示病虾的肝胰腺；a'：具HPNS症状病虾的肝胰腺，箭头指示病虾的肝胰腺；b：健康对虾症状，箭头指示健康对虾的肝胰腺；b'：健康对虾的肝胰腺，箭头指示健康对虾的肝胰腺；c：健康对虾肝胰腺组织病理观察；d：病虾肝胰腺组织病理观察，箭头指示肝小管间结缔组织受到破坏
2.2  肝胰腺坏死症凡纳滨对虾病毒检测和人工感染
采用PCR方法针对305尾具有HPNS症状的患病对虾进行对虾病毒检测携带情况。检测结果显示，可检测到WSSV、IHHNV2种病毒，BPV、MBV、HPV、YHV、TSV、IMNV、MOV、XSV、LSNV等其余9种病毒在所有样品中均未检测出。其中WSSV一扩中未检出，仅在二扩中检出，二扩
检出率为66.7%，IHHNV仅检出2例。
选取具典型HPNS症状的病虾头胸部组织制备组织匀浆液，分别用不经微孔滤膜过滤的组织匀浆液和经微孔滤膜过滤的组织匀浆液注射感染健康对虾，感染后7d统计结果，未过滤组对虾死亡率达到100%，表现典型肝胰腺坏死症状，过滤组对虾在实验期内没有死亡。对照组对虾在实验期内也没有死亡。感染结果表明病毒不是HPNS的主要病因。
2.3  肝胰腺坏死症凡纳滨对虾细菌分离鉴定
从63尾具HPNS症状的对虾不同组织中分离鉴定49种细菌，分别属于10个属。所有这些细菌中，肝胰腺分离鉴定34种细菌，肠道31种，血淋巴39种(表2)。
其中弧菌属Vibrio10种，包括副溶血弧菌V.parahaemolyticus、哈维氏弧菌V．harveyi、溶藻弧菌V．alginolyticus、霍乱弧菌V．cholera、河流弧菌V．fluvialis、创伤弧菌V．vulnificus、弗尼斯弧菌V．furnissii、远青弧菌V．azureus、需钠弧菌V．natriegens、拟态弧菌V．mimicus；芽孢杆菌属Bacillus11种，包括蜡样芽孢杆菌B．cereus、解淀粉芽孢杆菌B．amyloliquefaciens、地衣芽孢杆菌B．licheniformis、苏云金芽孢杆菌B．thuringiensis、枯草芽孢杆菌B．subtilis、高地芽孢杆菌B．altitudinis、死谷芽孢杆菌B．vallismortis、巨大芽孢杆菌B．megaterium、弯曲芽孢杆菌B．flexus、韩国芽孢杆菌B．koreensis、南海恩施芽孢杆菌B．ensch；气单胞菌属Aeromonas7种，包括豚鼠气单胞菌A．caviae、嗜水气单胞菌A．hydrophila、维罗纳气单胞菌A．veronii、温和气单胞菌A．sobria、斑点气单胞菌A．punctata、舒氏气单胞菌A．schubertii、肠棕气单胞菌A．enteropelogenes；微小杆菌属Exiguobacterium5种，包括印度微小杆菌E．indicum、金橙黄微小杆菌E．aurantiacum、乙酰微小杆菌E．acetylicum、深海微小杆菌E．profundum、海洋微球菌E．marinum；葡萄球菌属Staphylococcus6种，包括沃氏葡萄球菌S．warneri、木糖葡萄球菌S．xylosus、巴氏葡萄球菌S．pasteuri、路邓葡萄球菌S．lugdunensis、松鼠葡萄球菌S．sciuri、腐生葡萄球菌S．saprophyticus；不动杆菌属Acinetobacter3种，包括约氏不动杆菌A．johnsonii、泛耐药鲍曼不动杆菌A．baumnnii、溶血不动杆菌A．heamolyticus；希瓦氏菌属Shewanella3种，包括脱色希瓦氏菌S．decolorationis、海藻希瓦氏菌S．algae、鲍希瓦氏菌S．haliotis；发光杆菌属Photobacterium2种，包括美人鱼发光杆菌P．damselae和鳆发光杆菌P．leiognathi；肠杆菌属Enterobacter1种，阿氏肠杆菌Enterobacterasburiae；假单胞菌属Pseudomonas1种，包括弯曲假单胞菌P．geniculate。
在63尾患病对虾中，38尾对虾中鉴定有副溶血弧菌V．parahaemolyticus，其余25尾没有分离到，占鉴定对虾总数的60.3%；有蜡样芽孢杆菌B.cereus的对虾34尾，其余29尾没有分离到，占鉴定对虾总数的54.0%；有苏云金芽孢杆菌B．thuringiensis的对虾20尾，其余43尾没有分离到，占鉴定对虾总数的31.8%；有霍乱弧菌V．cholera的对虾19尾，其余44尾没有分离到，占鉴定对虾总数的30.2%；有金橙黄微小杆菌E．aurantiacum的对虾14尾，占鉴定对虾总数的22.2%；有嗜水气单胞菌A．hydrophila的对虾11尾，占鉴定对虾总数的17.5%；解淀粉芽孢杆菌B．amyloliquefaciens的对虾为7尾，分别占鉴定对虾总数的11.1%；其他种细菌分别从一些HPNS单尾虾中分离鉴定(表2)。不同种类细菌可以从不同的单尾HPNS病虾中分离，单尾HPNS病虾中最多鉴定细菌9种，最少鉴定细菌3种。以上结果表明多种细菌可能与对虾HPNS爆发有关。
表2  63尾HPNS对虾肝胰腺、肠道和血淋巴中分离鉴定的细菌
2.4  肝胰腺坏死症凡纳滨对虾细菌人工感染
用副溶血弧菌VP、苏云金芽孢杆菌BT、VP+BT混合菌分别注射感染健康对虾，在感染后6d全部死亡，死亡率100%，表现典型肝胰腺坏死症状。对照组死亡率为12%，没有肝胰腺坏死症状(图2)。用副溶血弧菌VP、苏云金芽孢杆菌BT、VP+BT混合菌分别浸泡感染健康对虾，感染组对虾缓慢死亡，在感染后14d统计结果，VP+BT混合菌感染组对虾死亡率较高，达到75%，VP感染组对虾死亡率达到66%，BT感染组对虾死亡率为62%，感染组死亡对虾表现典型肝胰腺坏死症状。对照组死亡率为16%，没有肝胰腺坏死症状(图3)。
图2  副溶血弧菌VP、苏云金芽孢杆菌BT、VP+BT混合菌注射感染对虾的情况
图3  副溶血弧菌VP、苏云金芽孢杆菌BT、VP+BT混合菌浸泡感染对虾的情况
取不同感染方式感染对虾进行病毒PCR检测，未检查到病毒。感染对虾重新进行细菌分离和鉴定，V1感染组对虾中分离鉴定出副溶血弧菌，Z7感染组对虾中分离鉴定出苏云金芽孢杆菌，V1+Z7混合感染组分离鉴定的细菌有副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌，两种细菌都可以分别从人工感染对虾中对应重新分离。这些结果表明副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌都可以感染健康对虾产生HPNS症状。
分别用副溶血弧菌VP、苏云金芽孢杆菌BT以及两者的混合菌液VP+BT注射感染和浸泡感染健康对虾，病虾均能产生与对虾自然发病的HPNS症状：摄食减少或不摄食，肝胰腺萎缩，B、F、Ｒ细胞坏死(图4)。
图4  副溶血弧菌VP和苏云金芽孢杆菌BT感染对虾组织病理观察
a：苏云金芽孢杆菌BT浸泡感染对虾的肝胰腺组织切片观察；b：副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌混合菌浸泡感染对虾的肝胰腺组织切片观察；c：副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌混合菌注射感染对虾的肝胰腺组织切片观察
3  讨论
有报道采用PCR方法证明WSSV、YHV、IMNV和TSV等对虾病毒不是EMS的病因。在本研究中我们运用PCR方法检测HPNS病虾11种对虾病毒，只有WSSV和IHHNV2种病毒可检测出，但病毒人工感染对虾并没有产生HPNS。因此对虾HPNS不是由单一病毒引起的。
为了确定HPNS产生是否与细菌有关，我们采集63尾HPNS病虾进行细菌分离鉴定，细菌可以从每一尾对虾的肝胰腺、血淋巴和肠道分离，经鉴定，这些细菌属于10个属，没有单一的一种细菌可以从所有63尾HPNS病虾中分离。比如，副溶血弧菌只从其中的38尾对虾中分离到，蜡样芽孢杆菌从其中34尾对虾中分离到，苏云金芽孢杆菌从其中20尾对虾分离到，霍乱弧菌从其中19尾对虾分离到。我们选择副溶血弧菌和苏云金芽孢杆菌人工感染健康对虾，所有发病对虾均表现HPNS症状。结果表明HPNS产生与多种细菌种类有关。
为什么HPNS产生会与多种细菌有关呢?我们认为这要归结于水体理化因子和有毒藻类的胁迫。HPNS爆发与水体理化因子(如氨氮，亚硝酸盐等)密切相关。在氨和亚硝酸盐浓度较高的养殖池塘越容易爆发HPNS感染。如果爆发HPNS疾病，减料停料可以有效降低养殖水体氨氮浓度并有效控制疾病的产展(未发表数据)。如果养殖池塘有毒藻类爆发，HPNS也会产生(未发表数据)。在对虾养殖中，减料和/或减少养殖密度将降低HPNS爆发的风险，而且对虾和不同鱼类(罗非鱼、草鱼、胡子鲶等)混养可以有效改善养殖环境并且降低HPNS爆发的风险(未发表数据)。因此，我们认为对虾养殖生态系统平衡被打破是HPNS爆发的根本原因，养殖生态系统紊乱，导致条件致病菌大量产生和氨氮胁迫，对虾处于亚健康状态，多种细菌包括在非胁迫条件下不能感染对虾的细菌也可以感染对虾。环境胁迫及导致条件致病菌繁生的生态系统是对虾发生HPNS的根本原因。