硝酸盐(NO ^ 3-)对南美白对虾的慢性毒性：存活率、生长、须长及病理变化

为了提高对虾养殖产量，有必要认真研究对虾养殖技术。在学习对虾养殖技术的过程中，逐渐积累了很多以前不知道的经验和方法，对提高对虾养殖产量有很大的帮助。

大卫库恩美国2010

摘要：没有证据表明硝酸盐(NO 3-)对对虾养殖有慢性毒性。为解决这一问题，需要在实验室循环水养殖系统中确定其对南美白对虾生长和存活的影响、系统中对虾的总数(对虾生物量)、对虾须的长度以及组织病理学变化。第一个实验(a)中，养殖盐度为11，对照组(a)中硝酸盐(NO 3-)浓度为35 ppm，其他各组硝酸盐(NO 3-)浓度分别为(A1)220ppm，(A2)435ppm，(A3)910ppm。对照组A和A1在存活率、生长量、虾生物量和虾须长度方面没有显著差异。A2组和A组的存活率和生长量差异不显著，但虾生物量和虾须长度差异显著(P0.05)。最后，A3组和A组在存活率、生长量、虾生物量和虾须长度方面存在显著差异(P0.05)。对照组和A1、A2、A3的组织病理学显示肝胰腺受损，三个实验组出现极少数虾鳃异常，如挂脏。在第二个实验(b)中，培养持续5周，以评估当培养物的盐度改变时硝酸盐(NO 3-)浓度升高的影响。实验对照组(B)的培养盐度为9，硝酸盐(NO 3-)浓度为18ppm。B1组盐度为9，硝酸盐(NO 3-)浓度为440ppm。B2组盐度为2，硝酸盐(NO 3-)浓度为440ppm。B3组盐度为18，硝酸盐(NO 3-)浓度为440ppm。在不考虑盐度的情况下，B1组、B2组和B3组的存活率、生长量和虾生物量与对照组相比差异显著(P0.05)。尽管B1组、B2组和B3组对增加的硝酸盐(NO 3-)浓度(440ppm)表现出负反应。然而，当硝酸盐(NO 3-)浓度为440ppm时，对虾的存活率和生物量随着养殖盐度的增加而显著增加(P0.05)。

　　1 前言

　　2 材料与方法

2.3实验设计

两个实验都有四个水平，每个水平又有三个平行水平。实验A研究了在硝酸盐含量增加、盐度为11的条件下，对南美白对虾进行42天的养殖。对照组(A)的硝酸盐(NO 3-)浓度为35 ppm，其他各组的硝酸盐(NO 3-)浓度分别为(A1)220ppm，(A2)435ppm和(A3)910ppm。实验B养殖35天，研究不同盐度下硝酸盐浓度对南美白对虾的影响。实验对照组(B)的培养盐度为9，硝酸盐(NO 3-)浓度为18ppm。B1组盐度为9，硝酸盐(NO 3-)浓度为440ppm。B2组盐度为2，硝酸盐(NO 3-)浓度为440ppm。B3组盐度为18，硝酸盐(NO 3-)浓度为440ppm。

2.4水质

养殖水体由井水和海晶组成(海晶产于美国)。硝酸盐的含量在实验室中由硝酸钠控制(美国谢尔化学公司)。实验中会自然积累一些硝酸盐，水的蒸发也会增加硝酸盐的浓度。因此，在实验中，在每个玻璃罐中同时加入等量的水，以补充蒸发损失的水分。实验中，水质检测方法和样品数量见表1。

　　3 结果

3.1不同程度硝酸盐对虾的影响

正如预期的那样，各组之间的差异在所有硝酸盐水平下都是显著的(P0.05)(表2)。水质指标没有观察到差异，这使得组间的比较有意义。

表2水质指标a和b的单因素方差分析，上标表示显著差异。

当硝酸盐含量超过220ppm时，实验A的存活率受到影响(图1)。最终生存率A组为87.14.0%，A1组为87.49.5%，A2组为64.210.7%，A3组为14.64.2%。14天后，A3组的存活率明显低于A组、A1组和A2组。

图1实验存活率

虾的生长与硝酸盐含量呈负相关。从培养的第21天开始，各组之间的生长有显著差异(P0.05)(图2)。实验结束时，A3组的虾明显小于其他组。最终生长速度A组为1.000.12克/周，A1组为0.840.06克/周，A2组为0.700.13克/周，A3组为0.240.18克/周。

图2；实验性生长情况

虾的生物量变化如图3所示。培养14d后，各组间生物量差异显著(P0.05)，生物量与硝酸盐水平呈负相关。A组的最终生物量为1587克/缸，A1组为13824克/缸，A2组为8614克/缸，A3组为4125克/缸。

图3；生物量实验情况

硝酸盐浓度的增加对虾须的长度有负面影响(见表3)。A组虾须长度显著长于A2组和A3组(P0.05)，A3组

组虾须的长度要显著短于其它组的（P<0.05）。

表3 ; ;A实验虾须长度的情况
　　A实验中，A1组、A2组、A3组的肝胰脏中均有病灶（图4）。肝胰腺管呈各种病变，一些肝胰腺管数目和尺寸减小，变为储存脂质的空泡。还有一些肝胰腺管缺乏上皮细胞，导致其膨胀扩张。这两种肝胰腺管都含有脱落的上皮细胞和细胞碎片。还有一小部分的肝胰腺管中有类似肉芽肿外观的东西，是坏死的、以细菌填充为中心的物体。从A1组到A3组，仅有极少数虾的鳃异常（图5）。细菌和没有固定形态的碎片，在许多虾的鳃丝上积累，而一些鳃的柱状上皮结构出现了损伤。

　　图4 实验A中，硝酸盐升高后，肝胰脏典型的病变，放大250倍的照片。一部分的肝胰腺管中有类似肉芽肿外观的东西，是坏死的、以细菌填充为中心的物体（g）。而其它小管扩张，缺乏上皮细胞（X）。这两种类型的小管在不同程度上含有脱落、坏死的上皮细胞和细胞碎片。

图5 实验A中，硝酸盐升高后，虾鳃典型性的挂脏，放大倍数为500倍。细菌和没有固定形态的碎片，在许多虾的鳃丝上积累（*），而一些鳃的柱状上皮结构出现了损伤（箭头）。
　　3.2 实验B：提高硝酸盐浓度在不同盐度下的影响
　　正与预期的那样，当硝酸盐变化时，盐度对各组的影响均显著（表2）。尽管溶氧和亚硝酸盐在各组间差异显著（P<0.05），但溶氧和亚硝酸盐的平均值均分别大于5.75 ppm或者小于0.26 ppm。
　　养殖一周后，实验B的存活率在各组间差异明显（P<0.05）（图6）。B2组在养殖14-21天时，死亡率出现了100%。在养殖的28天，存活率在所有的组别都显著的低于对照B组（P<0.05）。在硝酸盐浓度升高时，虾的存活率与盐度呈负相关。最终的存活率：B组 81.5±4.9%，B1组16.7±11.1%，B2组为0，B3组44.4±5.6%。

图6 ; ;B实验的存活率情况
　　在硝酸盐浓度升高时，虾的生长与盐度呈负相关。且在养殖14天之后，各组间生长的差异显著（P<0.05）（图7）。对照B组的生长速度最快。虾在硝酸盐水平较高时，其生长速度在盐度为9和18时（即B1与B2组之间），它们之间的差异不明显。在B2组，养殖14天时，虾没有生长。养殖到20天时，全部死亡，死亡率为100%。最终的生长情况：B组1.07±0.06克/周，B1组0.51±0.08克/周， B3组0.59±0.11 克/周。

图7 ; ;B实验中单个虾体重的情况
　　虾的生物量变化如图8。在养殖7天后，B组与其它组间差异显著（P<0.05）。在硝酸盐浓度升高时，盐度降低，对虾的生物量有负面影响。最终的生物量情况：B组114±2 g/缸，B1组15±24 g/缸，B3组41±4g/缸。

图8 ; ;实验B的虾生物量的情况

　　4 讨论

　　本研究表明，在养殖盐度为11，硝酸盐的浓度为220ppm时，虾可以养殖6个星期。同时，硝酸盐的浓度为435ppm，对虾的养殖是不安全的。蔡和陈在 2002年，根据Sprague1971年的实验数据，设计了斑节对虾的硝酸盐急性毒性试验的浓度梯度。在养殖盐度为15时，硝酸盐的安全浓度在南美白对虾养殖时估测为145ppm。尽管没有发表的文献表明硝酸盐的毒性，但是有文献对南美白对虾硝酸盐的安全浓度做出了建议。Van Wyk在1999年提出，对虾养殖硝酸盐的安全浓度要低于60ppm，但是没有提供科学依据。本实验从数据上支持了这一说法，但是他提出浓度的3.5倍以上（硝酸盐浓度220 ppm）。硝酸盐浓度在220 ppm，虾养殖几个星期后，虾的产量可能不会降低。当考虑到水和其它方面（如，能源使用，盐，水排放等）的资源节约的循环水养殖操作时，这种差异是显著的。如，若硝酸盐的含量是主要的关注变量，那么虾农在理论上就可以减少一半的换水率。
本实验对虾须长度进行了评估，因为它反映了虾的整体健康情况。虾须的主要作用是触角和感官知觉(New et al., 2010)。此外从活虾市场的角度考虑，有些消费者可能不接受虾短须(Gardner, 2010)。当硝酸盐的浓度在435ppm以及更高时，虾须的长度不被接受，因为要显著短于低浓度的。虾须损伤或较短，是虾不健康的早期症状(FAO, 2001)。或许，在本研究中，升高硝酸盐的浓度，打破了蜕皮激素内分泌的控制。在甲壳类动物中，记载了蜕壳和再生附属物是相互关联的(Madhavan and Madhavan, 1981)。尽管目前确切的机理尚不清楚，当虾在高水平的硝酸盐浓度的环境中持续一段时间后，虾须就没有再生的能力了。
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　　实验A的3个处理组，在硝酸盐浓度升高时，均表现出了不同程度的组织病变，尤其是肝胰脏和鳃。一些肝胰腺管数量减少，形成储存脂质的空泡。还有一些小管扩张，缺少上皮细胞。这表明虾可能摄食不正常或者代谢异常(Villalon, 1993)。还有少数的肝胰腺管内出现了肉芽肿状的物体，表明它对损伤产生了炎症反应或者损伤的肝胰腺细胞、上皮细胞对损伤组织进行包被 (Jiravanichpasal and Miyazaki, 1994; Estevea and Herrerab, 2000)。细菌和形状不规则的碎片，在许多虾的鳃丝上积累。这个可能是虾的清洗活动较少，或者是水中的悬浮物质较多造成的(Bauer, 1977, 2002; Martin et al.,2000)。有少数的虾鳃挂脏，报道说鳃挂脏会影响鳃部的水体交换，最后对虾体的健康造成不利影响(Bauer, 1979)。所有的这些变化表明，硝酸盐浓度的升高对虾的健康造成了不利影响，尽管虾体的表面体征不明显。实验B表明，硝酸盐在盐度较高的毒性较低。这些结果与其它报道的，除了硝酸盐以外的含氮废物毒性的强弱变化，随盐度的变化相一致(Linand Chen,2001;KirandKumlu,2006;Lietal.,2007)。对于硝酸盐来说，,Tsai and Chen在2002年发现，当养殖盐度从35降低到15ppm，硝酸盐对斑节对虾的毒性增强。虽然高盐度对含氮物质的毒性的抑制作用还没有搞明白，但据说，海虾在低盐度的环境中，它会受到附加的压力，代谢和其它相关物理过程会受到压制。虾的等渗点为18.5ppm，Castille and Lawrence在1981年报道其平均值在24.6ppm，Wyban and Sweeney在1991年报道其在10-15 ppm。离子交换（包括硝酸盐）的主要地点在虾的鳃部(Pequeux, 1995)。对虾在低盐度时，其血淋巴需要保持较高的渗透压对抗环境。如果这时是低渗状态就需要额外的消耗能量(Pequeux, 1995)。因此，毒性物质在长期威胁或短期之间进行比较时，少量的能量还是能够用来抵御毒性的。此外，低盐度时，在体内渗透压条件较低时，可以将水体中过多的硝酸盐吸入体内，对体内的渗透压进行调整(Mantel and Farmer, 1983; Kir and Kumlu, 2006)。
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　　抑制生长和死亡的原因可能主要包括代谢阻碍、摄食率降低以及损伤内分泌功能(Kurihara et al., 2008)。在水产养殖中，人们普遍认为毒物在导致其死亡前，抑制其生长。然而，在本实验中，硝酸盐浓度升高，对存活率的影响程度要大于对生长速度的影响。这一点尤其值得注意，因为虾农通常是依赖准确的生长数据，但确得不到准确的养殖数量，因为想知道养殖池塘中具体有多少虾比较困难。

　　5 结论
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　　总体上，这个硝酸盐的慢性毒性研究表明，在养殖盐度为11，硝酸盐浓度大于220ppm时，硝酸盐对南美白对虾的存活、生长和对虾生物量产生负面影响。硝酸盐的浓度在循环水养殖中已经报道超过了450ppm (Kuhn et al.,2009; Samocha Et al., 2010)。硝酸盐对存活率的抑制要超过对生长率的抑制。盐度降低，硝酸盐的毒性增强。硝酸盐对虾的慢性影响主要包括抑制虾须的生长、损伤肝胰脏，还有少数虾的鳃异常，如挂脏。本研究有助于水产从业者和虾农更好的管理养殖系统，避免硝酸盐带来的危害。

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　　译者：利洋公司技术部　陈明卫

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