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荧光偏振原理

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磷酸化的底物被荧光标记,而蛋白激酶产生的磷酸化产物则不被荧光标记。让两个磷酸化位点与抗丝氨酸抗体竞争(丝氨酸和苏氨酸是最常见的磷酸化位点,因为它们的结构末端含有羟基,这些羟基具有反应性,可以与磷酸基团结合)。

当反应溶液中没有蛋白激酶产生的磷酸化产物时,荧光标记的磷化物与抗体结合形成复合物。由于配合物较大,运动速率相对较小,因此偏振光产生的激发光具有较大的偏振值。当蛋白激酶产生的磷酸化产物处于反应溶液中时,由于两者竞争抗体的结合位点,结合抗体的荧光标记物较少,反应溶液中游离荧光标记物较多,因此发出的激发光的极化值减小。

蛋白激酶越活跃,产生的磷酸化产物越多,与荧光标记物的竞争就越激烈,对标记物产生的受激光的性质影响也越大,所以极化的变化与蛋白激酶的活性直接相关。这一原理可用于检测蛋白激酶活性。

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