前几天我和肖毅沟通过，他也在实验室搬砖。我了解到目前国内很多实验室已经实现了高精度、高速的WesternBlot。需要2 ~ 3天的WB，最快4小时就可以完成，出来的条状非常清晰美观。不得不感叹，实验制砖的过程需要与时俱进，很多时候可以找高效的仪器来节省。我开始博士生涯只有几个月，但我已经深深感受到自己的渺小和无尽的奋斗空间。我会一次又一次地更新【实验室技术学习笔记】。在未来，我也希望开设一个脑神经科学学习专栏，与朋友们分享我浅显的学习经验，让我们一起努力，一起追梦。

WesternBlot(WB)蛋白免疫印迹是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种检测蛋白质存在的实验方法。它的原理是特异性抗体能特异性地与它的抗原蛋白结合，使目标样品变色。通过分析图像的位置和信号深度，可以获得待分析细胞或组织中特定靶蛋白的行为信息。WB是一种经典而有效的蛋白表达定性和定量检测技术。

本实验室技术学习笔记是小何修改后的个人协议，仅供参考。

首先，提取细胞蛋白

我现在培养的细胞系是BV2细胞。传代后计数细胞数，取适量细胞放入培养箱CellTreat24h，用细胞裂解液刮取细胞收集。

【冰上全程操作】

2. 丢弃旧的培养基溶液并用PBS洗两次。

3.每个孔加入70ul新鲜制备的裂解液，立即放置在冰上，反复吹气，裂解10min，使用专用细胞刮痧，刮痧5min后，取细胞收集到EP管中。

4.30min后，将6孔板上的细胞收集到冰上的EP管中(尽可能多地刮掉细胞)。

5.12000rng, 4离心15min，取上清液入EP管作为提取蛋白。

二、组蛋白的提取

【冰上全程操作】

1. 取出动物组织，如脑，分成3个或更多(用于WBqPCR)，取出后立即-80保存。(PS:组织提取后立即用液氮冷冻/-80，反复冷冻样品会影响蛋白质的检测，最好用新鲜样品进行实验)

2. 准备细胞裂解液(立即使用)，组织：RIPA=1mg:10ul，可根据实际情况调整。RIPA:蛋白酶抑制剂：磷酸酶抑制剂=99:1:1。放在冰上。

3.切下约90mg的组织，在振荡匀浆器中匀浆。均质机的盖或芯通常放置在-20，使用时应取出。操作要快，均质机基本能保持温度1min。

4. 将匀浆加入90ul新鲜配制的裂解液中，在摇冰器中裂解30min。

5.12000g, 4离心15min，取上清液入EP管。

试剂盒：蛋白浓度测定试剂盒

2. 试剂reagentB3。试剂reagentS4。蛋白质标准溶液；ABS试剂室温保存，蛋白-20低温保存(可事先配置成梯度BSA溶液，-20低温保存)。

检测原理：在碱性条件下，蛋白质将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫色络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线比较，得到待测蛋白质的浓度。

检测流程：

建议：在加入SDS之前，最好将蛋白样品稀释至2.5g/uL的浓度(因为最终上样量为10uL，上样蛋白为20ug，其中第一次实验的蛋白样品变性前为8L，需要向含有5XSDS的LoadingBuffer中加入2uL)。因此最终蛋白浓度为2g/L)。每次制备的样品需要分成三个实验，即每个试管内装24uL，每管浓度为2.5g/L。使用时直接添加6uL LoadingBuffer, 10uL加载一次。如果细胞数量大，蛋白质浓度大，可将5XSDS稀释至1XSDS，将蛋白质样品稀释后再变性。

(5)电泳

电泳：上样前，将橡胶板下的气泡赶走，用注射器吸收电泳缓冲液打孔。阳性对照(即肯定表达目标蛋白的组织或细胞，也可以表明你的一抗的质量)或阴性对照(即肯定不表达目标蛋白的组织或细胞)可以根据实验需要设置。Marker(发酵)也使用1loadingbuffer调整到与样品相同的体积。样品上样后，应尽快进行电泳(注意正负极)，防止扩散。调压电泳初始电压为80V。溴芬兰游至分离胶处，过程持续约20min ~ 30min，电压改为120V，继续稳定电泳。蓝色缓冲液的最终状态不应超过底部支撑的绿色部分。电泳过程持续约60min ~ 90min。不同分子量蛋白质的电泳时间和电泳位置不同。

(6)跨膜

a.将下电极(负极)放平，并放置海绵垫片。

b.在海绵垫上放一张浸过转移缓冲液的滤纸，然后用玻璃棒做滚轮，将所有气泡挤出。如有必要，淋淋转移溶液以湿润。

c.取出浸在转移液中的凝胶，平放在滤纸上，消除所有气泡。

d.将PVDF膜置于聚丙烯酰胺凝胶上，使硝酸盐纤维素过滤膜与聚丙烯酰胺凝胶之间无气泡。

e.将最后一张滤纸放在PVDF膜上，再次确保没有气泡。

f.重新放置海绵垫片，盖住阳极板和卡箍。确保凝胶上有一定的压力。加入预冷的转膜液和内置冰盒，盖上盖子，接通电源，(注意正负极)电转40min,300mA(根据实验需要探索最佳转膜条件)。电转印过程中，尽量保持低温环境，可放置冰水转印膜。传输完成后，断开电源，拆除传输设备，逐层拆除。将凝胶转移到含有考马斯亮蓝染料的托盘中，染色以检查蛋白质转移是否完成。为了观察膜上的蛋白质，可以将膜染成李春红，然后用蒸馏水清洗。(上罐及传膜液可回收)。

(7)膜闭合

抗体杂交

间接法主要用于抗体表面。即先加入未标记的特异性抗体(Ab1，即一抗)与膜抗原结合，再加入标记的抗抗体(Ab2，即二抗)进行杂交检测。标记的Ab2物质包括放射性核素、酶和生物素。(抗体的稀释比例需要查清楚通常一抗浓度为1:2000 ~ 1:1000，具体稀释浓度可参考一抗说明书，二抗浓度为1:1000)。杂交过程如下：

A:在这种情况下，可以先培养A蛋白，然后把A蛋白的抗体洗掉，再培养B蛋白的抗体。

A:如果用奶粉制造抗体，通常会添加叠氮化钠。实验室制备叠氮化钠是10%的储备液，置于室温下储备，制备一抗时每1mL加入叠氮化钠10L，可使一抗保存时间约一个月，使用叠氮化钠时一定要小心，这种试剂是有毒的。

答：通常，如果您使用Bio-Rad的标准湿式转印装置，您可以将转印电流设置为300-400mA，转印时间设置为30-60分钟。也可以在15-20mA下过夜。具体的跨膜时间应根据靶蛋白的大小来确定。靶蛋白的分子量越大，所需的跨膜时间越长，而靶蛋白的分子量越小，所需的跨膜时间越短。

答：如果是大蛋白质(大于100kDa)，需要注意以下几点：

参考：

WesternBlot实验——蛋白跨膜染色